为了继承父亲帝野熊五郎（小山力也 配音）的遗嘱，高中生帝野将悟（樱井孝宏 配音）进入了贵族学校深流院学园学习如何成为一个合格社长，不仅如此，在接下来的两年中，将悟还必须在学园中找到可以托付一生的结婚伴侣。这可难倒了个性普通的将悟，不过，世上无难事，将悟愉快的高中生活就要开始了。 在生日的当天，将悟接到了一个自称是“妹妹”的女孩打来的电话，然而这位妹妹究竟是谁，将悟毫无头绪。在学园中，将悟结识了许多可爱的女孩子，有学级委员鹤真心乃枝（石原夏织 配音），沉默害羞的神凪雅（佐仓绫音 配音），高智商少女嵯峨良芽衣（日高里菜 配音）等人，而将悟感觉到，那个神秘的妹妹，就藏在这些花朵般柔软的女孩子们之中。
三人行必有我妹看了多个软妹角色，每个都有特点，比如沉默的雅和活泼的乃枝，对比鲜明，角色群像丰富。
三人行必有我妹看了开头就埋下‘妹妹’的谜团，吸引观众一直追下去，悬念感十足。
刚看完《三人行必有我妹》，结局揭晓了妹妹的身份，没有太突兀，符合之前的铺垫，很自然。